調(diào)整液相色譜儀的溫度后會對分離的選擇性產(chǎn)生影響，四種防腐劑的分離情況清楚地告訴我們，為什么用戶關(guān)心的不僅是檢測分析的速度還有分析的選擇性。雖然幾乎所有的現(xiàn)代化和和自動化的色譜儀都有色譜柱溫度控制功能，但在大多數(shù)情況下，色譜檢測分析方案的設(shè)計中色譜柱溫度并不是一個重要參數(shù)。

　　在實驗室的日常工作中，提高色譜柱溫度的首先是一種降低流動相粘度的方法，其次是在流量恒定時降低色譜柱背壓的方法，因此，提高柱溫就是提高液相色譜檢測分析的動力學(xué)性能。*，溫度提高之后不僅對色譜分析的速度有影響，而且對色譜柱中的物質(zhì)滯留情況也有影響。原則上，范特霍夫方程描述了不同溫度下某反應(yīng)的平衡常數(shù)：

　　公式1

　　公式1中的保留因子k描述的就是與色譜柱的溫度相關(guān)的系數(shù);

　　式中△H0表示的是流動相和 固定相之間分析物的焓變;

　　△Hs表示的是相應(yīng)的熵變;

　　ß是表示相位關(guān)系的反應(yīng)商。

　　從公式中可以清楚的看出：lnk與時間1/T之間的關(guān)系是線性關(guān)系，也就是說可以通過兩個檢測點就確定它們之間的相互關(guān)系，但實際中，線性關(guān)系都有很好的相似性，尤其是液相色譜檢測分析中，經(jīng)常會出現(xiàn)出現(xiàn)偏差。因此，在要求嚴(yán)格的色譜分析中至少要采集三個檢測點以上的數(shù)據(jù)，另外，應(yīng)放棄利用外推法對測量范圍以外的溫度進行預(yù)測。圖1所示的曲線就是非常有意思的范特霍夫方程曲線。這是鄰苯二甲酸二乙酯、苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯j(luò)ia酸乙酯四種防腐劑在極性基團的反相色譜法分離時，利用含磷酸鹽的水-甲醇洗脫液洗脫至酸堿度為PH 7時的色譜圖。檢測時，每5攝氏度進行一次檢測，在20攝氏度至75攝氏度的范圍內(nèi)的檢測結(jié)果顯示出很好的線性度，因此，即使用很少的檢測點也能夠很好地描述這種相互關(guān)系。特別引人注目的是各條直線有著不同的斜率，而不同的斜率終導(dǎo)致在觀察溫度范圍內(nèi)的洗脫點附近會出現(xiàn)直線交叉。這一點在實際工作中有著非常重要的意義，也是色譜分離成功與否的關(guān)鍵，必須給予高度的關(guān)注。

圖1 根據(jù)公式1得出的四種防腐劑的范特霍夫色譜曲線圖

圖2：四種防腐劑在12個不同溫度條件下的色譜分離圖

　　*的分析溫度

　　在實驗室日常工作中，通常都是在40攝氏度時開始HPLC液相色譜分離的。在這樣的溫度條件下不管洗脫液采用何種原理預(yù)熱、色譜柱溫度是如何監(jiān)控的，常規(guī)的色譜柱溫箱都能夠可靠地進行調(diào)整。改變前例中的溫度，即不是從40攝氏度開始，則注射到色譜柱中的四種物質(zhì)只有一個“帶肩”的色譜峰和一個乍看起來非常不起眼的色譜峰。這肯定不是適合這四種防腐劑樣本的色譜檢測方法，而不適合的唯yi原因就是選擇性對溫度的依賴關(guān)系。范特霍夫曲線告訴我們：在40攝氏度(垂直線)時苯甲酸甲酯和對羥苯j(luò)ia酸乙酯共洗脫，而此時鄰苯二甲酸二乙酯和對羥苯甲酸甲酯之間選擇性還有些不足。

　　在圖中可以看出鄰苯二甲酸酯和苯甲酸在范特霍夫曲線有著相似的斜率，這同樣也適用于兩個對羥基苯甲酸酯類，不同的是它們的保留時間對溫度的依賴性更強一些。究其原因是因為它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有所不同，所用固定相也有所不同，固定相中的烷基鏈中含有甲酰胺的功能。在它們的作用下氮的孤對電子會結(jié)合成氫鍵，氫氧基相當(dāng)強的氫鍵供體功能對兩種對羥基苯甲酸酯有著相當(dāng)強烈的相互作用，使它們兩種物質(zhì)不可能相互混合在一起。在這一分離系統(tǒng)中，對羥基苯甲酸酯的保留機制使其有著明顯更大的焓變，而這也確保了它的保留因子有著更強的溫度依賴性。

　　特殊的溫度在實驗室的實際應(yīng)用中有什么意義呢?在圖2可以看出，在20攝氏度時，方法選擇性洗脫的順序是鄰苯二甲酸二乙酯<對羥基苯甲酸甲酯<苯甲酸甲酯<對羥基苯j(luò)ia酸乙酯。如果逐步的升高溫度，在35攝氏度時，首先消失的是低于對羥基苯j(luò)ia酸乙酯的苯甲酸甲酯色譜峰;當(dāng)溫度升高到45攝氏度時，對羥基苯甲酸甲酯的色譜峰也超過了鄰苯二甲酸二乙酯色譜峰值，盡管在色譜柱中注入了四種物質(zhì)，但在給定的塔板數(shù)內(nèi)只能識別到兩個色譜峰;當(dāng)溫度進一步升高時，苯甲酸甲酯的色譜峰會推移到對羥基苯j(luò)ia酸乙酯的色譜峰之后;當(dāng)溫度超過60攝氏度時鄰苯二甲酸二乙酯的色譜峰也會推移到對羥基苯甲酸甲酯之后;在75攝氏度時，四種物質(zhì)的洗脫大致是等距洗脫，但洗脫順序有著明顯的變化。色譜圖的顏色表示了色譜分離的情況。標(biāo)記為綠色的色譜圖表示其定量方法是可以讓人接受的方法;黑色表示其方法至少是讓人們看到了所有的四種物質(zhì);在紅色譜圖中則多能夠識別出三種物質(zhì)，而在45攝氏度時則只能識別出兩種物質(zhì)。

　　除了洗脫順序發(fā)生了改變之外，四種物質(zhì)在75攝氏度時的保留時間都明顯縮短了。溫度在20攝氏度時保留因子k=2.6~k=6.6，在75攝氏度時保留因子減小到k=1.0~2.6。由于較低的選擇性和較低的保留因子，因此在溫度較高時的分辨率明顯下降了。另一方面，色譜分析時間也在多種因素作用下從1.3分鐘左右縮短到了0.6分鐘左右。原則上，一個必須注意的標(biāo)準(zhǔn)就是：個色譜峰的保留時間要大于k=1，后一個色譜峰的保留時間不要大于k=10。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)， 20攝氏度的分析方法明顯有著整體較高分辨率，是的分析方法。不到1.5分鐘的分析時間也屬于足夠快的色譜分析了。

　　有關(guān)溫度的選擇性優(yōu)化

　　利用范特霍夫方程可以通過幾次測量就能很好的預(yù)測物質(zhì)不同溫度下的保留因子k值。在一般情況下，在允許區(qū)域邊界的兩個溫度條件下的檢測就足夠了，但建議使用三個溫度、以便驗證線性度。得到的曲線能夠迅速地反應(yīng)選擇性的變化情況和洗脫順序的變化情況。這也就可以利用圖形來確定溫度了：當(dāng)圖中所有溫度點的垂直距離大時，選擇性的整體分布也是*的。