雞蛋過敏的人群為廣泛,國外已經(jīng)出臺了強(qiáng)制性標(biāo)識食品過敏原的法規(guī)，而國內(nèi)只有針對出口食品過敏源成分的標(biāo)準(zhǔn)，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法為主，需要開發(fā)制定高靈敏度的直接對常見致敏蛋白的定性定量方法，并制定相應(yīng)的標(biāo)識法規(guī)。

　　目前用于過敏原檢測的手段主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法、PCR法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。ELISA法是基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)，是現(xiàn)在為成熟的方法，但是由于各種加工手段使蛋白質(zhì)存在不同程度的變性，導(dǎo)致無法與抗體準(zhǔn)確結(jié)合，而且ELISA法不可避免存在交叉反應(yīng)且通量低，因此不適于對雞蛋過敏原的準(zhǔn)確定量。PCR法是基于DNA水平的檢測手段，而非直接對致敏蛋白進(jìn)行定量，但雞蛋含有極少量的DNA，并且雞蛋和雞肉中的DNA沒有差異性。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法廣受關(guān)注，其基于特征肽段有效地解決了變性蛋白的定量檢測問題，而且可以直接對蛋清致敏蛋白進(jìn)行高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度的檢測。

　　質(zhì)譜檢測方法具有高靈敏度與特異性的優(yōu)勢，可通過超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)建立雞蛋過敏原卵白蛋白的定量檢測方法，并進(jìn)行線性關(guān)系、檢出限、加標(biāo)回收等方法學(xué)驗(yàn)證，將所建方法應(yīng)用于實(shí)際商品中卵白蛋白的定量檢測，以期對食品中雞蛋過敏原的準(zhǔn)確定量提供技術(shù)支持。

　　1、特征肽段的篩選

　　首先篩選卵白蛋白中的特征肽段。將前處理后的樣品直接注入Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分離分析，將所得的肽段信息利用ProteinPilot軟件和Uniprot數(shù)據(jù)庫分析處理。與Uniprot數(shù)據(jù)庫結(jié)果比對后，得到多條肽段。然后根據(jù)如下特征肽段的篩選原則進(jìn)行特征肽段的篩選：以7～20 個(gè)氨基酸為宜;不含錯(cuò)切或漏切的酶切位點(diǎn);不含甲硫氨酸;具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì);進(jìn)行定性定量分析時(shí)，具有較好的靈敏度和峰形。終篩選到3 段響應(yīng)值較好、靈敏度較高的特征肽段，分別為LTEWTSSNVMEER(LR-13)、GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)、ELINSWVESQTNGIIR(ER-16)。所選擇的3 條肽段通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，確定肽段的唯yi性。

　　2、流動(dòng)相及多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)優(yōu)化

　　實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 種流動(dòng)相體系在相同的洗脫程序條件下特征肽段的響應(yīng)和出峰情況。結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，特征肽段的響應(yīng)和峰形都要優(yōu)于前者，拖尾現(xiàn)象明顯改善，穩(wěn)定性也有所提高。在電噴霧離子源正離子模式下，加入甲酸有助于肽類物質(zhì)離子化進(jìn)而提高分離效率和質(zhì)譜信號的強(qiáng)度，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

　　3、方法的線性關(guān)系、LOD和LOQ結(jié)果

　　分別精密移取混標(biāo)儲備液，用水稀釋配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以3 條特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)做線性回歸方程，并計(jì)算該方法的線性范圍。

　　4、基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

　　基質(zhì)效應(yīng)大于100%時(shí)，表明基質(zhì)對目標(biāo)物離子化有增益作用;基質(zhì)效應(yīng)小于100%時(shí)，表明基質(zhì)對目標(biāo)物離子化有抑制作用。結(jié)果表明，餅干(95.05%)、面包(90.68%) 、掛面(88.53%) 對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有不同程度的減弱作用，其中掛面的離子化抑制程度大;而蛋糕基質(zhì)(112.60%)對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有增益作用。

　　5、加標(biāo)回收率測定結(jié)果

　　卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)在基質(zhì)餅干1中回收率在83.32%～95.66%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于9.97%;在基質(zhì)餅干2中回收率在80.76%～98.55%之間，RSD不大于8.59%; 在基質(zhì)掛面中回收率在77.22%～92.68%之間，RSD不大于5.13%;在基質(zhì)蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之間，RSD不大于4.88%;在基質(zhì)蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之間，RSD不大于8.31%;在基質(zhì)面包中回收率在85.13%～91.36%之間，RSD不大于6.30%。

　　結(jié)論

　　通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法成功篩選到高特異性卵白蛋白肽段，并采用電噴霧質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、快速定量。該方法的建立為食品中雞蛋過敏原的檢測提供了技術(shù)支持，為推動(dòng)我國食品過敏原標(biāo)識的監(jiān)督與立法提供理論支持。